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【靶点模型+诊断质控】EGFR vIII的药物开发和诊断

发布时间:2021-12-28 10:50 |  点击次数:

基因背景:

 

表皮生长因子受体(EGFR/ErbB1/HER1)是酪氨酸激酶受体家族的成员,还包括ErbB2/HER2/Neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。所有这些受体都是跨膜糖蛋白,分子量范围从170到185kDa。通常,它的激活涉及配体结合和随后的受体二聚化。EGF受体的激活可在Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT或PLC/PKC通路中诱导信号,对多种细胞过程产生影响,包括增殖、代谢、凋亡、细胞存活或分化。信号级联的终止发生在受体内化后,主要是网格蛋白依赖性内吞作用,导致其进入早期内体。此外,受体可能被转运回细胞膜或在晚期内体和溶酶体中降解。

 

编码EGFR的基因位于7号染色体(p11.2)的短臂上,由28个外显子组成。成熟的EGFR蛋白(1186个氨基酸)由前体蛋白(1210个氨基酸)在去除N末端部分后形成。从N到C末端,EGFR由参与配体结合和受体二聚化的胞外域(外显子1-16)、疏水跨膜域(外显子17)和具有酪氨酸激酶活性的胞内域组成,其两侧是接头区域和受体的C端部分(外显子18-28)。细胞内结构域的20个酪氨酸残基中有12个被证明经历了磷酸化,这些结合受体激活后募集的膜结合或细胞质效应蛋白。

 

在GBM中,EGFR扩增在大多数情况下伴有基因重排。此类改变涉及特定外显子或外显子部分的缺失,并被指定为EGFRvI(N末端部分缺失)、EGFRvII(外显子14和15缺失)、EGFRvIII(外显子2-7缺失)、EGFRvIV(外显子25-27缺失)和EGFRvV(外显子缺失)25–28)。

 

在胶质母细胞瘤(GBM)中,最常检测到的变异之一是EGFRvIII。大约50%的GBM患者中EGFR发生了扩增,大约50-60%的扩增中同时伴随有EGFRvIII重排。EGFRvIII的出现是由于EGFR外显子2-7的缺失,产生了一个能够组成型EGFR激活的截短的细胞外结构域。截短的细胞外结构域产生了一个新的肽序列,从而产生了独特的、GBM细胞特异性、抗体反应性EGFRvIII抗原。





Fig 1. EGFR WT和EGFR vIII的结构示意图


药物开发
 

从临床角度来看,胶质母细胞瘤是最困难的肿瘤之一,并且仍然缺乏对诊断出患有这种肿瘤类型的患者的有效治疗方法。迄今为止,开发了许多治疗方法来治疗患有EGFR vIII阳性胶质母细胞瘤的患者。

 

目前关于EGFR/EGFR vIII疗法的临床和临床前试验包括小分子酪氨酸激酶抑制剂、抗体、疫苗以及基于RNA干扰的疗法。由于特定信号通路中单个基因的沉默可能不足以在GB患者中提供治疗效果,因此需要一种复杂的方法,专注于几种信号转导通路。




Table 1. 单独针对EGFR vIII、同时针对EGFR WT和EGFR vIII的在研疗法


药靶模型
 

科佰生物针对EGFR WT和EGFR vIII靶点开发in vitro的体外测活模型,可以用于小分子抑制剂的抗肿瘤增殖抑制的活性检测。



 

Fig 2. EGFR WT (EGF Dependent)/BaF3体外测活模型,以human EGFR WT基因替代IL-3,作为Baf3增殖的驱动基因。



Fig 3. EGFRvIII/BaF3体外测活模型,以human EGFR vIII(自磷酸化)基因替代IL-3,作为Baf3增殖的驱动基因。
 

分子诊断
 

在GBM的诊断中,NCCN指南提到了EGFR amplification和EGFR mutation,EGFR vIII的突变可以既称为EGFR mutation,又经常会导致EGFR的扩增,因此是一个重要的诊断指标。
 




Fig 4. NCCN-2021第二版中枢神经系统肿瘤分子标志物截图


诊断标准品

 

科佰生物通过基因编辑的方式,在EGFR的1号内含子和7号内含子上切割基因组DNA,人工编辑出E2-E7del的样本,适用于DNA和RNA两个层面的分子诊断标准品。

 


Fig 5. DNA层面EGFR vIII的断点,ddPCR检测突变频率为100%。

 


Fig 6. RNA层面EGFR vIII的断点,ddPCR检测为6700copies/ng。